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問答題

【案例分析題】

我們實驗室研究生做了一個如下的實驗:將pdc基因(丙酮酸脫羧酶)克隆到pUC18載體中,以便在E.coli TOP10中表達,這個pdc基因兩側(cè)具有BamHI的位點,因此計劃將它從BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格按分子克隆實驗手冊中進行:載體用BamHI切割后,立即用堿性磷酸酶處理,接著將處理過的載體同用BamHI切割的pdc基因混合,加入T4連接酶進行溫育,連接后,將DNA同處理過的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合。最后將混合物涂布在加有氨芐青霉素、IPTG和x-gal固體培養(yǎng)基的平板上。 
實驗中同時設(shè)置了4個對照: 
對照1:將未同任何載體接觸過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 對照2:將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對照3:將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用T4連接酶連接(但沒有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對照4:將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過)并用T4連接酶連接(但沒有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
在進行第一次實驗時,感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落(見下表1)。在第二次實驗中,自己制備感受態(tài)細(xì)胞,但這一次,所有的平板上都沒菌落生長(見下表1)。接著又進行了第三次實驗,這次得到了轉(zhuǎn)化子(見下表1)。從實驗平板上挑出12個菌落,分離質(zhì)粒DNA,并用BamHI進行切割,其中9個克隆產(chǎn)生大小同載體pUC18一樣的單一的一條帶,另3個克隆中切出一個pdc基因,實驗終于獲得成功。

第三次實驗如何進行轉(zhuǎn)化子的挑選?并說明其原理?

答案: 第三次試驗挑選白色菌落為重組克隆。其原理是pUC18載體LacZ’和受體菌E.coli TOP10的LacZ△...
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問答題

【案例分析題】

我們實驗室研究生做了一個如下的實驗:將pdc基因(丙酮酸脫羧酶)克隆到pUC18載體中,以便在E.coli TOP10中表達,這個pdc基因兩側(cè)具有BamHI的位點,因此計劃將它從BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格按分子克隆實驗手冊中進行:載體用BamHI切割后,立即用堿性磷酸酶處理,接著將處理過的載體同用BamHI切割的pdc基因混合,加入T4連接酶進行溫育,連接后,將DNA同處理過的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合。最后將混合物涂布在加有氨芐青霉素、IPTG和x-gal固體培養(yǎng)基的平板上。 
實驗中同時設(shè)置了4個對照: 
對照1:將未同任何載體接觸過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 對照2:將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對照3:將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用T4連接酶連接(但沒有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對照4:將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過)并用T4連接酶連接(但沒有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
在進行第一次實驗時,感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落(見下表1)。在第二次實驗中,自己制備感受態(tài)細(xì)胞,但這一次,所有的平板上都沒菌落生長(見下表1)。接著又進行了第三次實驗,這次得到了轉(zhuǎn)化子(見下表1)。從實驗平板上挑出12個菌落,分離質(zhì)粒DNA,并用BamHI進行切割,其中9個克隆產(chǎn)生大小同載體pUC18一樣的單一的一條帶,另3個克隆中切出一個pdc基因,實驗終于獲得成功。

影響第二次實驗結(jié)果的原因是什么?對照2的作用何在?

答案: 如果用未切割的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞得不到菌落,也是由于某種錯誤所致。這也有幾種可能:其一是感受態(tài)細(xì)胞制備得不合適,因而不能攝取質(zhì)...
問答題

【案例分析題】

我們實驗室研究生做了一個如下的實驗:將pdc基因(丙酮酸脫羧酶)克隆到pUC18載體中,以便在E.coli TOP10中表達,這個pdc基因兩側(cè)具有BamHI的位點,因此計劃將它從BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格按分子克隆實驗手冊中進行:載體用BamHI切割后,立即用堿性磷酸酶處理,接著將處理過的載體同用BamHI切割的pdc基因混合,加入T4連接酶進行溫育,連接后,將DNA同處理過的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合。最后將混合物涂布在加有氨芐青霉素、IPTG和x-gal固體培養(yǎng)基的平板上。 
實驗中同時設(shè)置了4個對照: 
對照1:將未同任何載體接觸過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 對照2:將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對照3:將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用T4連接酶連接(但沒有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對照4:將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過)并用T4連接酶連接(但沒有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
在進行第一次實驗時,感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落(見下表1)。在第二次實驗中,自己制備感受態(tài)細(xì)胞,但這一次,所有的平板上都沒菌落生長(見下表1)。接著又進行了第三次實驗,這次得到了轉(zhuǎn)化子(見下表1)。從實驗平板上挑出12個菌落,分離質(zhì)粒DNA,并用BamHI進行切割,其中9個克隆產(chǎn)生大小同載體pUC18一樣的單一的一條帶,另3個克隆中切出一個pdc基因,實驗終于獲得成功。

對照3和4各有什么作用?

答案: 對照3是檢查切割載體的末端是否預(yù)期的一樣,以及連接酶是否具有活性。限制性內(nèi)切酶的制備物(或是所用的緩沖液)偶爾會污染外切...
問答題

【案例分析題】

我們實驗室研究生做了一個如下的實驗:將pdc基因(丙酮酸脫羧酶)克隆到pUC18載體中,以便在E.coli TOP10中表達,這個pdc基因兩側(cè)具有BamHI的位點,因此計劃將它從BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格按分子克隆實驗手冊中進行:載體用BamHI切割后,立即用堿性磷酸酶處理,接著將處理過的載體同用BamHI切割的pdc基因混合,加入T4連接酶進行溫育,連接后,將DNA同處理過的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合。最后將混合物涂布在加有氨芐青霉素、IPTG和x-gal固體培養(yǎng)基的平板上。 
實驗中同時設(shè)置了4個對照: 
對照1:將未同任何載體接觸過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 對照2:將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對照3:將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用T4連接酶連接(但沒有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對照4:將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過)并用T4連接酶連接(但沒有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
在進行第一次實驗時,感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落(見下表1)。在第二次實驗中,自己制備感受態(tài)細(xì)胞,但這一次,所有的平板上都沒菌落生長(見下表1)。接著又進行了第三次實驗,這次得到了轉(zhuǎn)化子(見下表1)。從實驗平板上挑出12個菌落,分離質(zhì)粒DNA,并用BamHI進行切割,其中9個克隆產(chǎn)生大小同載體pUC18一樣的單一的一條帶,另3個克隆中切出一個pdc基因,實驗終于獲得成功。

為什么要用堿性磷酸酶處理載體?

答案: 用堿性磷酸酶處理載體以除去5’磷酸,可防止載體自連。載體的重新連接,可以產(chǎn)生很高的帶有載體而沒有插入物的菌落...
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【案例分析題】

我們實驗室研究生做了一個如下的實驗:將pdc基因(丙酮酸脫羧酶)克隆到pUC18載體中,以便在E.coli TOP10中表達,這個pdc基因兩側(cè)具有BamHI的位點,因此計劃將它從BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格按分子克隆實驗手冊中進行:載體用BamHI切割后,立即用堿性磷酸酶處理,接著將處理過的載體同用BamHI切割的pdc基因混合,加入T4連接酶進行溫育,連接后,將DNA同處理過的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合。最后將混合物涂布在加有氨芐青霉素、IPTG和x-gal固體培養(yǎng)基的平板上。 
實驗中同時設(shè)置了4個對照: 
對照1:將未同任何載體接觸過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 對照2:將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對照3:將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用T4連接酶連接(但沒有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對照4:將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過)并用T4連接酶連接(但沒有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
在進行第一次實驗時,感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落(見下表1)。在第二次實驗中,自己制備感受態(tài)細(xì)胞,但這一次,所有的平板上都沒菌落生長(見下表1)。接著又進行了第三次實驗,這次得到了轉(zhuǎn)化子(見下表1)。從實驗平板上挑出12個菌落,分離質(zhì)粒DNA,并用BamHI進行切割,其中9個克隆產(chǎn)生大小同載體pUC18一樣的單一的一條帶,另3個克隆中切出一個pdc基因,實驗終于獲得成功。

pUC18表達的是pdc基因融合蛋白還是純pdc基因產(chǎn)物?為什么?

答案: pUC18載體表達的產(chǎn)物是pdc基因的融合蛋白,因為在pUC18載體的多克隆位點后有一段lacZ’片段,它是β-半乳糖苷...
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【【案例分析題】】

我們實驗室研究生做了一個如下的實驗:將pdc基因(丙酮酸脫羧酶)克隆到pUC18載體中,以便在E.coli TOP10中表達,這個pdc基因兩側(cè)具有BamHI的位點,因此計劃將它從BamHI的位點插入載體中。實驗嚴(yán)格按分子克隆實驗手冊中進行:載體用BamHI切割后,立即用堿性磷酸酶處理,接著將處理過的載體同用BamHI切割的pdc基因混合,加入T4連接酶進行溫育,連接后,將DNA同處理過的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合。最后將混合物涂布在加有氨芐青霉素、IPTG和x-gal固體培養(yǎng)基的平板上。 
實驗中同時設(shè)置了4個對照: 
對照1:將未同任何載體接觸過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 對照2:將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對照3:將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用T4連接酶連接(但沒有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對照4:將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過)并用T4連接酶連接(但沒有pdc基因)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
在進行第一次實驗時,感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的,結(jié)果,在所有的平板上都長出了多到無法計數(shù)的菌落(見下表1)。在第二次實驗中,自己制備感受態(tài)細(xì)胞,但這一次,所有的平板上都沒菌落生長(見下表1)。接著又進行了第三次實驗,這次得到了轉(zhuǎn)化子(見下表1)。從實驗平板上挑出12個菌落,分離質(zhì)粒DNA,并用BamHI進行切割,其中9個克隆產(chǎn)生大小同載體pUC18一樣的單一的一條帶,另3個克隆中切出一個pdc基因,實驗終于獲得成功。

第三次實驗如何進行轉(zhuǎn)化子的挑選?并說明其原理?

答案: 第三次試驗挑選白色菌落為重組克隆。其原理是pUC18載體LacZ’和受體菌E.coli TOP10的LacZ△...
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